Сайт дистанционных консультаций для студентов заочной формы обучения товароведческого факультета ФГОУ ВПО ИВМ ОмГАУ специальностей "Товароведение и экспертиза товаров" и "Стандартизация и сертификация".
Биохимия продуктов питания
Лабораторная работа 3.
Обнаружение действия ферментов
Источниками ферментов являются животные и растительные ткани, а также дрожжи и другие микроорганизмы. Существует несколько методов выделения ферментов. Основной из них извлечение фермента водой на холоду из тканей, высушенных каким либо обезвоживающим веществом, ацетоном или солевыми растворами. Хорошо высушенные и измельченные препараты тканей измельчают и экстрагируют водой (или глицерином), отделяют жидкость центрифугированием. Ферменты водного экстракта осаждают и высушивают, либо водный экстракт подвергают лиофильной сушке.
Ферменты в биологическом материале можно обнаружить, по признакам реакции, в которой они участвуют. Это может быть изменение окраски реакционной смеси или индикатора, выпадение осадка или выделение газообразных продуктов и т.п. Действие ферментов можно обнаружить не только по появлению продуктов реакции, но и по уменьшению концентрации субстрата в ходе ферментативной реакции.
Опыт 1. Получение сахаразы из дрожжей
Сахараза (К.Ф. 3.2.1.4.) катализирует гидролитическое расщепление гликозидной связи в молекуле сахарозы, при этом образуется глюкоза и фруктоза. Глюкозу обнаруживают реакцией Фелинга.
Ход работы. Разотрите 50 г дрожжей в ступке, нанесите их тонким слоем на стекло и высушите в токе сухого воздуха. Высушенные дрожжи разотрите в порошок. К полученному порошку прилейте небольшими порциями 200 мл воды и оставьте в термостате на 1-2 часа (25-30оС). Затем массу профильтруйте через складчатый бумажный фильтр. Отфильтрованная вытяжка содержит фермент сахаразу (используйте ее для опыта 2).
Опыт 2. Действие сахаразы
Ход работы. В две пробирки возьмите по 3 мл раствора сахарозы и добавьте в одну 0,5 мл воды, в другую 0,5 мл раствора сахаразы (экстракта дрожжей). Поместите обе пробирки в водяную баню на 10 минут (37оС). Затем в добавьте в них по 3 мл реактива Фелинга и нагрейте до кипения. В пробирке с вытяжкой фермента образуется красный осадок оксида меди (I), что указывает на присутствие глюкозы.
Опыт 3. Действие пероксидазы
Пероксидаза (К.Ф.1.11.1.7.) является одним из компонентов ферментативного звена антиоксидантной системы (АОС) организма. Этот фермент востанавливает пероксид водорода до воды с использованием различных редуцирующих веществ, главным образом полифенолов. Кофермент пероксидазы гем. В отличие от каталазы перкосидаза катализирует не только разложение пероксида водорода, но и гидропероксидов жирных кислот, пероксидов белкового и нуклеинового происхождения, пероксидов стеролов, простагландинов. Перкосидаза присутствует почти во всех растительных и животных клетках. Наиболее активная пероксидаза выделена из корней хрена.
Ход работы.
Реакция с бензидином. Небольшое количество измельченного корня хрена (или картофеля) поместите в пробирку, добавьте 1 мл спиртового раствора бензидина и 2 капли раствора пероксида водорода. Наблюдайте появление темно-синего окрашивания.
Проделайте данную пробу с прокипяченным экстрактом корня хрена. Наблюдается ли действие пероксидазы в этом случае?
Опыт 4. Действие каталазы
Ход работы: в две пробирки поместите по 2 мл водного экстракта мышечной ткани. Раствор в одной пробирке прокипятите. Затем в обе пробирки добавьте по пять капель 5%-ного раствора пероксида водорода. Объясните, почему происходит бурное выделение кислорода только в одной пробирке.
Оформление работы: запишите принцип обнаружения действия ферментов, название каждого опыта, уравнения реакций, название и шифр фермента.
Реактивы и оборудование: 1% раствор сахарозы, реактив Фелинга, 3% раствор пероксида водорода, 1% спиртовый раствор α-нафтола, 1% раствор диметилпарафенилендиамина, 10% раствор бензидина, раствор фенолфталеина, 2% раствор гидрокарбоната натрия, 1% раствор крахмала, раствор иода; дрожжи, кровь цельная и разбавленная, панкреатин, молоко, картофель, корень хрена; ступка с пестиком, предметные стекла, пробирки, спиртовки, держатели для пробирок, водяная баня.
Вопросы для самопроверки
1. Дайте определение понятий "ферменты" "проферменты", "коферменты".
2. Охарактеризуйте химическую природу ферментов?
3. Как можно выделить ферменты из биологического материала?
4. Дайте определение понятий "фермент-субстратный комплекс", активный центр фермента", "аллостерический центр фермента".
5. Какова роль апофермента и кофермента в процессе катализа?
6. Приведите примеры, доказывающие высокую эффективность действия ферментов.
7. Приведите примеры действия полифенолоксидазы в технологических процессах переработки пищевого сырья?